25 Giugno 2015 Consegna della perizia sul materiale genetico presente nella lettera inviata a Silvia Della Monica

Il 25 giugno 2015, a seguito dell’incarico del 22 aprile 2015, il Dott. Ugo Ricci consegna la consulenza sul materiale genetico presente nella lettera inviata a Silvia della Monica.

Questa la consulenza: 25 giugno 2015 Perizia di Ugo Ricci DNA Busta lettera a Silvia Della Monica

La consulenza certifica la presenza di materiale biologico di Nadine Mauriot, ma non evidenzia nessun altro materiale genetico conosciuto o ignoto.

Nelle varie parti della busta e del contenuto esaminato emerge un frammento di materiale presente all’interno dell’involucro di materiale plastico. Il frammento è evidentemente non organico in quanto non presenta DNA, di colore giallo, presumibilmente a forma di stella e di circa 1 o 2 mm di dimensione.

Questa la trascrizione:

PROCURA DELLA REPUBBLICA 

PRESSO IL TRIBUNALE DI FIRENZE 

CONSULENZA TECNICA IN MATERIA DI GENETICA FORENSE 

Procedimento penale N° 7372-2015 RGNR 

Dott. Paolo Canessa Sost. Proc. 

Consulente Dott. Ugo Ricci Specialista in Genetica Medica 

Dottore di ricerca in Scienze Forensi 

Albo dei Consulenti Tribunale di Firenze n° 6941 

Sommario 

1. INCARICO …………3
2. ACQUISIZIONE E DESCRIZIONE DEI REPERTI ……….…….3
3. ACCERTAMENTI TECNICI ……………. 4
   1. DIAGNOSI DI NATURA ….. 4
   2. Esame con amilasi………….. 4
4. DIAGNOSI INDIVIDUALE.,,,, 5
   1. Estrazione del DNA………. 5
   2. Determinazione dei profili genetici autosomici… 6
5. CONCLUSIONI…… 10
6. MATERIALI E METODI…………… 11
   1. Diagnosi generica di saliva – metodo all’amilasi …… 11
   2. Diagnosi individuale – esame del DNA……….. 11
      1. Estrazione del DNA……… 11
      2. Scelta dei marcatori…….. 12
      3. Amplificazione genica…. 12
      4. Elettroforesi capillare……… 12
      5. Interpretazione dei risultati…….. 12
7. PRODOTTI UTILIZZATI …. 13
8. DOCUMENTAZIONE FOTOGRAFICA…………… 14
9. DOCUMENTAZIONE ANALITICA….. 30

Riferimento interno di laboratorio del caso forense 441 

1. INCARICO 

In data 22-04-2015, alle ore 15.45, negli Uffici della Procura della Repubblica di Firenze, il Pubblico Ministero Dott. Paolo Canessa, in riferimento al procedimento n° 7372-2015 nei confronti di ignoti, mi affidava incarico di consulenza tecnica ex art 359 c.p.p. formulando il seguente quesito: 

“Proceda il C.T. all’esame del contenuto del reperto custodito sigillato in atti al fine di accertare se sullo stesso siano reperibili eventuali tracce utili all’estrazione del DNA”. 

Per lo svolgimento dell’incarico mi veniva consegnato il reperto, custodito in una busta gialla chiusa con nastro adesivo trasparente con intestazione del Ministero degli Interni Prot. 123/8693 Pol. Scientifica ed indicazione “contiene una busta da lettera dei ritagli di giornale ed altro inviati alla Dott.ssa Della Monica” di cui si allega una fotocopia “ante retro” al presente verbale. 

Per lo svolgimento dell’incarico la S.V. Ill.ma concedeva il termine di giorni 30 a decorrere dall’inizio delle operazioni che veniva stabilito per il 22-04-2015, indicando che il proseguimento sarebbe avvenuto presso l’Azienda Ospedaliero-Universitaria “Careggi”, SOD Diagnostica Genetica a Firenze. 

Riferisco su quanto emerso dagli accertamenti tecnici di laboratorio. 

2. ACQUISIZIONE E DESCRIZIONE DEI REPERTI 

II reperto è costituito da una busta di colore giallo (ril. n° 1 e 2), all’interno della quale è conservata la busta di colore bianco inviata all’epoca dei fatti, già esaminata dalla polizia giudiziaria per la ricerca di tracce di amilasi e impronte papillari latenti. Il recto della busta (ril. n° 3) presentava ritagli di giornale incollati per l’indicazione del destinatario, rimossi e custoditi all’interno di una bustina (ril. n° 4). E’ presente un francobollo con timbro “San Piero a Sieve”, dal quale è stato rimosso un frammento, senza intaccare il suddetto timbro (ril. n° 5). Il campione è stato contrassegnato con il codice 441-F. 

Sul verso della busta si notano due piccole soluzioni di continuo, rappresentate dai prelievi già effettuati dalla polizia giudiziaria. Nell’area in corrispondenza della chiusura è stato prelevato un ulteriore frammento (441-G) per le indagini di natura (ril. n° 6, 7 e 8). 

Nella parte interna della busta sono presenti tracce di grafite, costituita dai tentativi di esaltazione di impronte papillari da parte degli inquirenti (ril. da 9 a 12). Sono stati effettuati alcuni prelievi in corrispondenza di alcune aree in cui erano presenti linee papillari, allo scopo di verificare l’eventuale presenza di materiale genetico ancora utile per l’identificazione di colui che aveva toccato l’oggetto. Tali prelievi sono stati contrassegnati dai codici 441-C, 441-D e 441-E. 

All’interno della busta era inoltre contenuto un frammento di cellophane trasparente, a doppio strato, così da formare una sorta di contenitore, interessato esternamente da tracce di grafite. All’interno si notano due frammenti di materiale di colore arancio, di 1 mm circa, di aspetto rotondeggiante. Uno di questi frammenti è stato prelevato ed esaminato per la caratterizzazione biologica e genetica (ril. n° 15, prelievo contrassegnato dal codice 441- A). E’ stato poi effettuato un prelievo (441-B) mediante strofinamento di un tampone sterile all’esterno del cellophane e uno (441-B2) nell’interno del cellophane. 

3. ACCERTAMENTI TECNICI 

Una più precisa descrizione dei metodi usati è inclusa nella sezione Materiali e Metodi. 

3.1 DIAGNOSI DI NATURA 

Tutti i campionamenti sono stati avviati alle analisi generiche, volte all’identificazione della natura del materiale biologico eventualmente presente sui prelievi. 

3.1.1 Esame con amilasi 

Tutti i campioni sono stati esaminati mediante il kit amilasi per l’identificazione di saliva e tracce contenenti essudati. I risultati sono espressi su scala NEG / +++. 

Tabella

Tutti i campioni, anche quelli negativi ai test di cui sopra, sono stati quindi avviati all’estrazione del DNA. 

4. DIAGNOSI INDIVIDUALE 

Il protocollo analitico utilizzato per l’esecuzione degli accertamenti genetici segue le raccomandazioni suggerite dalla International Society of Forensic Genetics (ISFG) 1, dai Genetisti Forensi Italiani 2, 3 e dall’ENFSI 4. La descrizione delle singole attività è meglio descritta nel capitolo “Materiali e metodi”. 

4.1 Estrazione del DNA 

Ciascuno dei reperti e dei prelievi prima indicati è stato sottoposto a estrazione del DNA mediante metodiche automatizzate. 

4.2 Quantificazione del DNA 

Il materiale genetico estratto è stato quantificato con metodica Real-Time PCR utilizzando un sistema analitico (Quantifiler Trio, LifeTechnologies) in grado di determinare le quantità relative di DNA maschile e di DNA totale. La tabella seguente riporta i risultati ottenuti: 

Tabella

1 www.isfg.org 

2 Pascali VL, Novelli G, Pignatti P, Raccomandazione sulle indagini biologiche di paternità e le indagini d’identificazione criminale. Analysis n° 3, 2000. 

3 Tagliabracci A, Domenici R, Pascali VL, Pesaresi M, Indagini genetico-forensi di paternità e identificazione personale. Linee Guida metodologico-Accertative Criteriologico-Valutative. Piccin Editore 2007. 

4 ENSFI – ENFSI document on DNA-database management 2011 

Tabella

4.3 Determinazione dei profili genetici autosomici 

Per la determinazione del profilo genetico dei campioni è stato utilizzato un sistema in grado di amplificare contemporaneamente ventitré marcatori del DNA, più il marcatore amelogenina per la determinazione del genere e tre marcatori del cromosoma Y. I marcatori sono costituiti da microsatelliti (o short tandem repeats o STR, anche conosciuti come simple sequence repeats o SSR) sequenze ripetute di DNA non codificante costituiti da unità di ripetizione molto corte (3-5 bp) disposte secondo una ripetizione in tandem. 

Essi presentano un alto livello di polimorfismo, nel senso che hanno variazioni di lunghezza negli individui, permettendo quindi di caratterizzarli e differenziarli in maniera inequivocabile. 

Tabella

Esempio di una zona polimorfica del DNA con la sequenza gata ripetuta undici volte 

Il sistema utilizzato è denominato PowerPlex® Fusion 6C System (Promega, USA) e contiene tutti i marcatori suggeriti nell’European Standard Set (ESS), di cui al progetto di risoluzione del Consiglio d’Europa del 30 novembre 2009 sullo scambio dei risultati delle analisi del DNA (2009/C 296/01). 

I risultati della quantificazione hanno evidenziato valori molto ridotti di materiale biologico, prossimi allo zero, ad eccezione del campione 441-B2, prelevato dall’interno del cellophane. Questo campione risulta costituito da DNA femminile, in quanto non si è evidenziata l’amplificazione della sonda corrispondente al cromosoma Y. 

In ogni caso tutti i campioni sono stati sottoposti all’analisi genetica, volta all’individuazione dei profili genetici del donatore/dei donatori. Tuttavia il solo campione idoneo alle analisi è stato il reperto 441-B2, analizzato considerando si tratta di un campione a basso numero di copie di DNA. Per l’analisi e l’interpretazione si è adottato il metodo suggerito da Caragine et al. (2009); una forma allelica viene descritta qualora sia osservata almeno due volte in amplificazioni indipendenti. Per quei marcatori ove si osservi solo una forma allelica si aggiunge una lettera “Z” che evidenzia come possa esistere nel profilo originario una ulteriore forma allelica (soggetto eterozigote) non rilevata dall’esame sul reperto. In questo modo viene descritto un profilo detto “consenso” che è rappresentativo del DNA di partenza. 

Successivamente il profilo è stato confrontato con quello determinato dalle tracce ematiche femminili rinvenute nella tenda nella quale furono rinvenuti cadaveri Janine Nadine Gisel Mauriot e Jean Michel Kraveichvili. Il profilo della traccia 441-B2 risulta compatibile con il profilo della ragazza, per i marcatori a comune. 

Le tabelle seguenti riportano i risultati ottenuti: 

Tabella

Tabella

Il profilo genetico ottenuto dalle tracce dentro il cellophane, comparato con le tracce femminili rinvenute all’interno della tenda. 

5.CONCLUSIONI 

Sulla base delle indagini di laboratorio effettuate e in base alle valutazioni biostatistiche di cui sopra, posso così rispondere ai quesiti posti dalla S.V. Ill.ma: 

L’esame della busta da lettera e del contenuto, inviati alla Dott.ssa Silvia della Monica, volto all’individuazione di tracce biologiche ha evidenziato quanto segue: 

• nel francobollo e nella chiusura della lettera non sono state rilevate tracce di saliva né di materiale biologico umano; 
• non sono state, inoltre, evidenziate tracce biologiche nella carta presente all’interno della busta; 
• all’interno del cellophane trasparente sono state evidenziate tracce biologiche dalle quali è stato possibile determinare un unico profilo genetico femminile, identificato quale DONNA SCONOSCIUTA 1; 
• tale profilo genetico è riconducibile, al di là di ogni ragionevole dubbio, al profilo genetico femminile individuato, in varie sedi, nella tenda nella quale furono rinvenuti cadaveri Janine Nadine Gisel Mauriot e Jean Michel Kraveichvili. 

La busta da lettere con tutto il contenuto viene riconsegnata, insieme alla presente consulenza, all’Autorità Giudiziaria. 

Firenze, 25 giugno 2015 

Il consulente Dott. Ugo Ricci 

6. MATERIALI E METODI 

6.1 Diagnosi generica di saliva – metodo all’amilasi 

Aliquote del campione da testare sono incubate con acqua bidistillata, allestendo controlli positivi e negativi, per due ore circa a temperatura ambiente. Parte del surnatante è stata quindi utilizzata per l’esame di natura, utilizzando il kit Amilasi (Sclavo Diagnostics), che si basa su un substrato cromogenico, il 2-cloro-4-nitrofenolo legato al maltotrioso. La reazione diretta della a-amilasi con il substrato comporta la formazione del 2-cloro-4-nitrofenolo. Il kit risponde agli isoenzimi dell’amilasi sierica, pancreatica, urinaria e salivare. Il principio del metodo si basa sul fatto che l’a-amilasi (a-1, 4 glucano, 4-glucanoidrolasi) catalizza l’idrolisi di un substrato sintetico, il 2-cloro-4-nitrofenil-a-D- maltotrioside (CNPG3), per formare il 2-cloro-4-nitrofenolo (CNP), il 2-cloro-4-nitrofenil- a-D-maltoside (CNPG2), maltotrioso (G3) ed il glucosio. 

CNPG3 _______Amilasi__________CNP + CNPG2 + G3 + glucosio 

Dopo un’incubazione di 2 ore a 37°C, la formazione del 2-cloro-4-nitrofenolo (CNP) determina un viraggio del colore al giallo, che viene valutato visivamente. 

6.2 Diagnosi individuale – esame del DNA 

6.2.1 Estrazione del DNA 

Per l’estrazione del DNA è stata utilizzata la stazione robotizzata BioRobot EZ1 Advanced (QIAGEN, Germany) in associazione con Investigator Card ed EZ1® DNA Investigator Kit (QIAGEN, Germany). Il DNA ottenuto è stato quantificato mediante metodica Real-Time usando il kit Quantifiler Trio (Life Technologies) in associazione a uno strumento QuantStudio 6-Flex (Thermo Fisher Scientific). 

6.2.2. Scelta dei marcatori 

I marcatori analizzati sono quelli suggeriti dalla Commissione Europea per lo standard ESS e sono accettati dall’intera comunità internazionale anche per la formazione di database del DNA 5. La tabella riassume i marcatori del DNA esaminati: 

6.2.3 Amplificazione genica 

L’analisi di tutti i reperti in esame è stata effettuata utilizzando PowerPlex® Fusion 6C System (Promega, USA) secondo le indicazioni contenute nello User Manual. 

6.2.4 Elettroforesi capillare 

La corsa elettroforetica è stata effettuata su sequenziatore automatico 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). 

6.2.5 Interpretazione dei risultati 

I risultati sono stati interpretati inizialmente per confronto con miscele di alleli noti e controlli positivi, in modo da individuare l’esatto aplotipo individuale, assegnando numeri che corrispondono al numero delle sequenze ripetute per ogni allele, in accordo con le direttive dettate dall’ISFG (International Society of Forensic Genetics), organismo europeo che detta le linee guida per le indagini di genetica forense 6. 

Il software utilizzato per l’analisi dei profili elettroforetici è GeneMapper v.ID-X. 

5 http://www.councilforresponsiblegenetics.org/dnadata/fullreport.pdf 

6 http://www.isfg.org/Publications 

Tabella

7. PRODOTTI UTILIZZATI 

Tabella

8.DOCUMENTAZIONE FOTOGRAFICA 

Fotografie

9.DOCUMENTAZIONE ANALITICA 

Tabelle